پزشکان بدون مرز درمان
خانه / اخبار علوم پايه / آشنایی با دستگاه HPLC

آشنایی با دستگاه HPLC

گردآورنده: سیمین سکاکی
استاد محترم : دکتر رودباری

مقدمه:

کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه “کروما” به معنی رنگ و “گروفین” به معنی نوشتن است. در سال 1903 برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیل‌سوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده می‌شود یکی از پرکاربردترین روش‌های جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روش‌های دیگر ناممکن است به راحتی می‌توان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافات‌های جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آن‌ها از یک سیستم کروماتوگرافی می‌شود‌. این روش بسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطیر چندین روز به طول بینجامد، می‌تواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیار کوتاه انجام گیرد، وسایل مورد لزوم آن نیز ارزان قیمت است.

به گزارش خبرنگار سایت پزشکان بدون مرز،  کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا ( (High Efficiency Liquid Cgromotography (HPLC ) بدون سؤال ، سریع‌ترین رشد را در بین تمام روش‌های جداسازی تجزیه‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش ، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی صحیح ، شایستگی آن برای جداسازی مواد گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم‌تر از همه ، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌های مختلفی علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند.

تاریخچه:

پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.

در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.

در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش روماتوگرافی ستونی انجام شد.به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوال مطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟

توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.

در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC  ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.

به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای  HPLC  بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm  3  تا   µm  200 دارد.

طول ستونهای HPLC سریع ،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  3  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند. هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط   50 درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد.در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود

فاز متحرک:

عموما فاز متحرک حاوی مخلوطی از حلالهای قطبی نظیر الکل و غیر قطبی نظیرهیدروکربنها است. با کنترل ترکیب و قطبیت فاز متحرک در روش گرادیان حلال می توان زمان و حجم باز داری مواد را در ستون HPLC کنترل نمود.فاز متحرک در HPLC باید چنان انتخاب شود که در آشکار ساز مزاحمت ایجاد نکند . معمولا مخلوطهای متانول , اتانول یا پروپانول با هپتان و کلروفرم با هپتان را به عنوان فاز متحرک در HPLC مورد استفاده قرار می دهند. در HPLC فاز معکوس عموما از مخلوط متانول یا استونیتریل با آب به عنوان فاز متحرک استفاده می شود.

استفاده از نانوالماس‌ها در كروماتوگرافي مايع با كارآيي بالا :

پاول نسترنکو و همکارانش در دانشگاه ايالتي مسکو در روسيه توانستند با استفاد از نانوالماس‌‌ها به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافي مايع با کارآيي بالا (HPLC) مخلوطي از هيدروکربن‌هاي آروماتيک را به خوبي از هم جدا کنند.

يکي از چالش‌هاي موجود در کروماتوگرافي، توسعه ويژگي‌هاي ستون کروماتوگرافي براي انجام جداسازي بهتر و با انتخابگري بالاتر بوده است.

فازهاي ساکن مختلفي مورد استفاده قرار گرفته‌اند، اما تنها معدودي از آنها نيازمندي‌هاي لازم را از جهت پايداري شيميايي و مکانيکي را برآورده کرده‌اند.
الماس‌ها ماده ايده‌آلي براي پر کردن ستون مي‌باشند، چرا که پايداري بسيار بالايي داشته و در نتيجه مي‌توانند در دماها و فشارهاي بالا و در حضور اسيدها و بازهاي قوي، و حلال‌هاي آلي قوي مورد استفاده قرار بگيرند.

نسترنکو توضيح مي‌دهد: «با اين حال الماس طبيعي بسيار گران بوده و ذرات الماس مصنوعي کوچک‌تر از آني هستند که در اين ستون‌ها مورد استفاده قرار بگيرند».
براي حل مشکل هزينه و اندازه ذرات، نسترنکو يک فناوري پخت توسعه داده است که او را قادر مي‌سازد نانوالماس‌هاي مناسب HPLC را به دست آورد. او از طريق پخت نانوالماس‌ها در فشار 12000 مگاپاسکال و دماي 1200 درجه سانتي‌گراد، ذرات الماس متخلخل چندبلوري را در ابعاد ميکرومتري توليد کرد.

اين مواد گروه جديد و جالبي از فازهاي ساکن هستند، زيرا در عين حالي که ويژگي‌هاي اصلي الماس را حفظ کرده‌اند، برهمکنش‌هاي بسيار جالبي با ماده مورد تجزيه نشان مي‌دهند

انواع کروماتوگرافی:

 کروماتوگرافی تقسیمی

 کروماتوگرافی تبادل یونی

 کروماتوگرافی جذب سطحی

 کروماتوگرافی طردی

کروماتوگرافی تقسیمی :

کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از 3000 مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند.

به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند.

کروماتوگرافی تبادل یونی:

در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن
استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کنندهکاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند.

یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان  یابد.

کروماتوگرافی جذب سطحی:

در روش hplc از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول  بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها دارد.

معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در 150 تا 200 سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد.با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.

کروماتوگرافی طردی:

روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب روماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد.

مزایای این روش:

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است .

و دلیل این محبوبیت:

1- حساسیت روش
2- سازگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح
3- مناسب بودن آن برای جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی
4- کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت در صنعت
5- زمینه های مختلف علوم و جامعه

کاربرد های کروماتوگرافی مایع:

*برای مواد حل شده ای که وزن مولکولی بزرگتر از 10000 دارند کروماتوگرافی طردی
*برای گونه های یونی با وزن مولکولی پایین کروماتوگرافی تبادل یونی
*گونه های کوچک قطبی اما نایونی از کروماتوگرافی تقسیمی
*و برای جداسازی گونه های ناقطبی , ایزومرهای ساختاری و دسته ترکیباتی از قبیل هیدروکربنهای آلیفاتیک از الکلهای آلیفاتیک از کروماتوگرافی جذب سطحی استفاده می کنند.

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC:

1.  مخازن حلال:

كه در آنها فاز متحرك و يا حلالهاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.

2. موتور يا پمپ:

چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه حلال جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند. و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حلال توسط پمپ با فلوي ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر فلوئي كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو فرق مي كند، هر چه فلو كمتر باشد، فاصله ي پيك ها بيشتر است. چهارمخزن داريم مخزنD, C, B, A ميزان فشار بستگي به فلوي ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلو ريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتي آن را بداخل دستگاه وارد مي كند. در دماي آزمايشگاه كار مي كنيم.

به دو روش مي توانيم كار كنيم:

* روش ايزوكراتيك isocratic: اگر نسبت هاي مختلفی از فاز متحرك را در يك مخزن بريزيم و از همان  مخزن فاز متحرك را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيك استفاده كرده ايم. مثلا در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرك( 80% بافر فسفات 12%  متانل و 8% استونيتريل) است كه پس از صاف كردن همه را در يك مخزن مثل D مي ريزيم و از همان مخزن پمپ برداشت  مي كند.

* روش گراديانت gradient :اجزاء فاز متحرك در مخازن مختلف ريخته مي شود. دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت هاي مختلف را از مخازن برداشت كند (طبق داده هاي ما)، مثلا می خواهيم ازمخزن A، 80% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بكشد. و بعد نسبت ها را مخلوط مي كند.

از اين روش وقتي استفاده مي كنيم كه نسبت هاي موردنظر را نمی دانيم و بخواهيم روش کارپيدا كنيم. ولي وقتي درصد فاز متحرك براي ما روشن شد مي توانيم از روش ايزوكراتيك استفاده كنيم. فاز متحرك با فلوي ثابتي بر روي ستون حركت داده مي شود حداكثر فلو در این آزمایش ml/min0.8 يا 1 است. بعد از فعال كردن هر پمپ flow rate را از كم به زياد كم كم بالا مي بريم تا حدود ml/min  0.8 يا 1 و مي گذاريم حدود يك ربع ساعت يا نيم ساعت با فلوريت بالا كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين مي آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض مي كنيم.

يا دستگاه را خاموش مي كنيم، فلوريت كه بالا برود فشار هم بالا مي رود. بعد از اتمام كار ستون را با حلالهاي شستشو دهنده مي شوئيم.  حلالهاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال مي كنيم اول دستگاه را با آب و متانل شسته و سپس با متانل خالص مي شوئيم. هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتداهوا گیری کنیم.

انواع پمپ:

1- پمپ های پیستونی
2- پمپهای جابه جایی یا سرنگی
3- پمپ های فشار ثابت یا بادی

ویژگی سیستم های پمپ کننده:

1.تولید فشارهای تا PSi600
2. خروجی بدون تپ
3. سرعت جریان در گستره 1/0 تا ml/min10
4.کنترل جریان و تکرارپذیری جریان تا 5/0% نسبی ویا بهتر
5. اجزای سازنده مقاوم در مقابل خوردگی (فولادهای مختلف زنگ نزن یا تفلون)

3. Injector:

از سرنگهاي مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق 30 ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.

4. ستون:

طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو مي دهيم. فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود، گارد كالوم را پس از مدتي بايد عوض كرد، ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست.

اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و حلال قطبي باشد. سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.

انواع ستون :

ستون های کروماتوگرافی مایع
ستون های تجزیه ای
ستون های محافظ

ستون های کروماتوگرافی مایع:

این نوع ستون ها معمولا از لوله های فولاد زنگ نزن با منفذ یکنواخت ساخته می شوند , گرچه لوله های شیشه ای یا جداره ضخیم نیز گاهی به کار می روند . لوله های شیشه ای با فشارهای کمتر از psi 600    محدود می شوند.

ستون های تجزیه ای:

طول اکثر ستونهای کروماتوگرافی مایع 10 تا 30 سانتیمتر است. معمولا ستونها مستقیم اند و قطر داخلی ستونهای مایع اغلب 4 تا 10 سانتیمتر است و متداولترین ذرات پرکننده ها 5 و 10 میکرومتر است. متداولترین ستون در حال کار این روزها , ستونی با طول 25 میکرومتر پرشده است. و این ستونها می توانند 40000 تا60000 بشقابک در متر دارد.

ستون های محافظ:

اغلب یک ستون کوتاه محافظ قبل از ستون تجزیه ای به کار می رود تا با حذف نه تنها مواد آلاینده ها از حلالها , بلکه همچنین اجزای نمونه که بطور برگشت ناپذیر با فاز ساکن پیوند می دهند,عمر ستون تجزیه ای را افزایش دهد. همچنین در این روش ستون محافظ برای سیر کردن فاز متحرک با فاز ساکن به کار می رود تا اتلاف این حلال در ستون تجزیه ای را به حداقل برساند. اندازه ذرات در ستون بزرگ است تا افت فشار را به حداقل برساند.

انواع پر کننده های ستون:

پرکننده ذرات پوسته دار

پرکننده متخلخل

پرکننده ذرات پوسته دار: از دانه های شیشه ای یا بسپاری نامتخلخل کروی با قطر نوعی از 30 تا 40 میکرومتر تشکیل شده است و جنس لایه متخلخل سیلیس , آلومین و یا یک رزین تبادل یونی روی سطح این دانه ها رسوب داده شده است. ممکن است دانه ها در اثر اعمال شیمیایی دارای سطحی آلی شوند. اخیرا پرکننده های پوسته دار عمدتا در ستون های محافظ و نه برای ستونهای تجزیه ای به کار می روند.

پرکننده متخلخل: این نوع پر کننده ها از ریز ذراتی با قطری در گستره 3 تا 10 میکرومتر تشکیل میشود برای یک اندازه معین تلاش میشود تا گستره اندازه ذره به حداقل برسد.این ذرات از سیلیس –آلومین و یا رزین تبادل یونی تشکیل شده اند که سیلیسی متداول تر است. ذرات سیلیس از تجمع ذرات سیلیس ریز میکرون در شرایطی سنتز می شوند که به ذرات بزرگتر کاملا یکنواخت منجر شوند.

5. آشکارسازها:

رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد. عامل وجودی آشکارگر در hplc, آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید. یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستند به عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.

تعریف دو نوع اصلی آشکارساز:

آشکارسازها با خاصیت گروهی : به خاصیت فاز متحرک مانند ضریب شکست ثابت دی الکتریک یا چگالی که با وجود جسم حل شده مدوله میشودجواب میدهند.

آشکارسازها با خاصیت جسم حل شده: به خاصیتی از جسم حل شده مانند جذبUV    – فلوئورسانس یا جریان نفوذ,  که فاز متحرک فاقد آن است جواب میدهد.

مشخصات آشکارساز ایده آل:

علاوه بر اینکه آشکار سازها در این روش نیازی ندارد به گستره ای به آن وسعت از دما جواب بدهد. علاوه براین برای کاهش پهن شدگی منطقه , آشکار ساز HPLC باید حداقل حجم درونی را داشته باشد
حساسیت کافی
پایداری خوب و تکرار پذیر
قابلیت اعتماد بالا و سهولت کاربرد
زمان جواب کوتاه که مستقل از سرعت جریان است.

انواع آشکارساز:

آشکارسازهای جذبی
آشکارسارهای فلورسانسی
آشکارسازهای ضریب شکست
آشکارسازهای الکتروشیمیایی

آشکار ساز های جذبی:

آشکارگرهای جذب UV عمومی ترین آشکارگرHPLC به حساب می آیند. اصول کارکرد آن براین مبناست که فاز متحرک از ستون به درون محفظه ای کوچک جاری میشود.

محفظه در مقابل اشعه uv/visible منتشر شده از دستگاه نورسنج یاطیف سنج قرار میگیرد. این آشکارگرها انتخابگر بوده , فقط میتوانند اجزاء نمونه ای از نور uv را جذب می کنند آشکار سازند. و برای به حداقل رساندن پهن شدگی نواراضافی ستون , حجم چنین سلولی را تا حد امکان کوچک نگه می دارد. بنابراین حجمها به 1تا 10 میکرو لیتر و طول سلولها به 2 تا 10میلی لیتر محدود میشوند.

آشکارسازهای فلورسانسی:

بسیاری از مواد میتوانند نورuv را جذب کرده و سپس اشعه ای در طول موج بالاتر پخش کنند. این پخش یا سریعاصورت میگیرد( فلورسانس) یا باکمی تاخیر (فسفرسانس) و معمولا نور جذب شده که دو مرتبه در طول موج بالاتر پخش میشودبسیار کم است. اما برای بعضی مواد این میزان بین 1/0 تا1 می باشد. و این روش برای آشکار شدن این مواد مناسب میباشد . موادی که بطور طبیعی خاصیت فلورسانسی دارند دارای ساختمان حلقوی مزدوج هستند.

آشکار سازهای ضریب شکست:

این آشکارگر برمبنای اختلاف ضریب شکست جزء نمونه خارج شده از ستون
ضریب شکست فاز متحرک خالص ( به عنوان شاهد) بنا نهاده شده است. تا زمانی که مابین جزء نمونه و فاز متحرک اختلاف شکست نور موجود باشد میتوان گفت که این آشکارگرها نزدیکترین وسیله در HPLC به عنوان آشکارگر جامع می باشند.

آشکارگرهای الکتروشیمیایی:

آشکارگرهای الکتروشیمیایی , هدایت مواد شسته شده را اندازه می گیرند و یا جریان بوجود آمده توسط اکسایش و احیاء جزء نمونه را تعیین می کنند در حالت اول جزء نمونه باید یونی باشد و در حالت دوم جزء نمونه باید براحتی اکسید یا احیاء گردد. نوع اول را آشکارگرهای سنجش رسانایی ویژه گویند .

6. ثبات (ركوردر):

در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به  مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند.به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان باز داري يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان بازداري فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است.

براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است. ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند. روش رسم منحني را انجام مي دهيم. در محور افقي غلظت ها و در محور عمودي AUC . بعد از رسم منحني استاندارد، غلظت مجهول را از روي رسم منحني بدست مي آوريم.

تفاوت HPLC با  GC:

1.چون اغلب مواد آلي ناپايدار و كم فرار هستند. براي كار با GC بايد آنها را به مشتقات فرار تبديل كرد كه ايجاد مشتقات فرار و باقی ماندن جزئي از مصرف مشتق ساز ايجاد پيك هائي مي كند كه نتايج آزمايش را مختل مي سازد حال آنكه جداسازي اين گونه مواد با HPLC به آساني امكان پذير است.

2. دو فاز ثابت و متحرك در HPLC بطور رقابتي عمل مي كنند و جداسازي بوسيله دو فاز انجام مي شود در صورتي كه در GC يك فاز يعني فاز ثابت عمل جداسازي را انجام مي دهد.

3. يكي از مزاياي HPLC وجود دتكتورهاي آنست كه براي هر دسته از تركيبات دتكتورهاي انتخابي ويژه وجود دارد كه اين تنوع دتكتورها از مزاياي HPLC است. در صورتي كه در GC دتكتور ها محدود تر می باشد.

4. مدت آناليز در HPLC فوق العاده اندك است، آناليز تركيبات آلي ناپايدار و كم فرار مواد خوراكي، شيميايي داروئي توسط HPLC امكان پذير است.

5.  مواد بسيار قطبي را با GC نمي توان آناليز كرد در صورتي كه با HPLC مي شود.

6.  در HPLC به سبب دو فاز رقابتي پيك ها معمولا بصورت متقارن هستند در صورتي كه در GC اغلب پيك ها بصورت نامتقارن هستند و محاسبه مساحت زير منحني يا AUC با اشكال و خطا است. ولي در HPLC بعلت وجود تقارن محاسبه AUC دقيق انجام مي شود.

7. وجود آب در نمونه هاي آزمايش در HPLC اشكال ايجاد نمي كند در صورتي كه در GC وجود اندك آب سبب تخريب دتكتور مي شود.

8. وجود آب در شبكه كريستالي، وجود مولكولهاي آب ئيدروژن در HPLC قابل تشخيص ولي در GC قابل ارزيابي نيست.

9. وجود ناخالص ها بخصوص ناخالصي هاي بسيار قطبي و يا با وزن مولكولي بالا در HPLC قابل تشخيص ولي در GC قابل تشخيص نيست.

منابع:

http://WebShimi.ir
http://daneshnameh.roshd.ir
http://starbiotech.blogfa.com
http://www.nano.ir
http://water-research.persianblog.ir
شیمی دستگاهی زیر نظر دکتر علی معصومی
کروماتوگرافی مایع با بازدهی عالی  – سندی لیندسی
اصول تجزیه دستگاهی جلد2
کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19
با تشکر از خانمها: فاطمه جبرائیلی مقدم، زهره ترسلی و زهرا ترسلی

تلگرام

مطلب پیشنهادی

درمان جدیدی برای اعتیاد به اینترنت

بسیاری از مردم در طول هفته ساعات زیادی را پای اینترنت سر می‌کنند اما بعضی …

ارتباط چاقی کودکان با مواد شیمیایی موجود در پلاستیک‌ها

پژوهشگران “دانشگاه نیویورک”(NYU) در مطالعه اخیرشان دریافته‌اند چاقی کودکان می‌تواند با مواد شیمیایی موجود در …